ABSTRACT
Diversos aditivos químicos han sido utilizados para garantizar la polimerización de genes con islas CpG. El objetivo de este trabajo fue diseñar una mezcla potenciadora de PCR para amplificar genes con islas CpG. Con ese fin se analizaron fragmentos de los genes IRS2 y HNF1a con el programa EMBOSS CpG Report. Los iniciadores se diseñaron con el programa Primer 3 y se analizaron con el programa e-PCR. Se usaron tres aditivos químicos: Albúmina sérica bovina (0,1µg/µL), dimetilsulfóxido (5%) y formamida (5%) para 5 ensayos de PCR: dos usando un solo aditivo, dos combinando dos aditivos y uno combinando tres aditivos. Las amplificaciones con las mezclas se realizaron con las enzimas Taq Nativa, taq Recombinante y Taq Platinum. La calidad de los amplicones se probó por secuenciación. Fragmentos sin islas CpG (HNF-1a) amplificaron con las tres enzimas, sin el uso de los aditivos pero presentaron problemas de pureza en la secuenciación. Los fragmentos del gen IRS2 con islas CpG amplificaron sólo con la combinación de tres aditivos dimetilsulfóxido, albúmina sérica bovina y formamida, independientemente de la enzima usada, las secuencias fueron limpias. Se concluye que la mezcla de tres aditivos es una solución que permite obtener amplicones de alta calidad en genes con islas CpG, con cromatogramas limpios en la secuenciación.
Several chemical additives have been used to assure polymerization in CpG islands.The aim of the present work was to design a PCR enhancer mixture in order to amplify GC-rich genes. Fragments of IRS2 and HNF1a genes were analyzed using EMBOSS CpG Report Software. Primers were designed with the Primer3 Software and were tested with ePCR Software. Three additives were used: BSA (0.1µg/µL), DMSO (5%) and formamide (5%), in five PCR assays, two using one additive, two combining two additives and one with all additives. DNA sequences were amplified with the following enzymes: Native Taq, recombinant Taq and platinum Taq DNA polymerase. Amplicon quality was examined by sequencing. HNF1a gene was amplified without additives; however, the sequences were not amplified and showed purity problems in sequencing. The gene fragments IRS2 with CpG islands were amplified with additives DMSO, BSA and Formamida mixture, notwithstanding the enzyme used. These sequences were clean. DMSO-BSA-Formamide mixture can be a solution to obtain GC-rich DNA amplicons with such a high quality that it generates neat chromatograms during sequencing.
Diversos aditivos químicos têm sido utilizados para garantir a polimerização de genes com ilhas CpG. O objetivo do trabalho foi desenhar uma mistura que potencie PCR para amplificar genes com ilhas CpG. Para esta finalidade foram analisados fragmentos dos genes IRS2 e HNF1a com o programa EMBOSS CpG Report. Os iniciadores foram desenhados com o programa Primer 3 e se analisaram com o programa e-PCR. Foram utilizados três aditivos químicos: Albumina sérica bovina (0,1µg/µlL, Dimetilsulfóxido (5%) e formamida (5%) para 5 ensaios de PCR: dois usando um único aditivo, dois combinando dois aditivos e um combinando três aditivos. As amplificações com as misturas se realizaram com as enzimas, Taq Nativa, taq Recombinante e Taq Platinum. A qualidade das ampliações foi provada por sequenciação. Fragmentos sem ilhas CpG (HNF-1a) amplificaram com as três enzimas, sem o uso dos aditivos porém apresentaram problemas de pureza na sequenciação. Os fragmentos do gene IRS2 com ilhas CpG amplificaram apenas com a combinação de três aditivos dimetilsulfóxido, albumina sérica bovina e formamida, independentemente da enzima usada, as sequências foram limpas. A conclusão que a mistura de três aditivos é uma solução que permite obter ampliações de alta qualidade em genes com ilhas CpG, com cromatogramas limpos na secuenciação.
Subject(s)
Animals , Cattle , Polymerase Chain Reaction , CpG Islands/genetics , DNA/blood , Polymerase Chain Reaction/veterinary , Genetic Diseases, Inborn/diagnosisABSTRACT
El presente artículo tiene el objetivo de establecer el perfil de la demanda total y la oferta potencial de servicios de salud, disponible para las enfermedades de alto costo o enfermedades catastróficas en el Fondo de Protección contra Gastos Catastróficos (FPCGC) del Sistema de Protección Social en Salud (SPSS). En los fundamentos del diseño financiero del Fondo se consideró estática la realidad sanitaria, al descontar los efectos de los cambios epidemiológicos y no precisar las necesidades de salud de la población, demanda oculta. De esta manera, cuando esta demanda se revela, se transforma en demanda efectiva para las instituciones de salud y se trastocan los supuestos deplanificación utilizados en los cálculos financieros del Fondo. Por lo anterior, se concluye que es imprescindible una definición metodológica del Consejo General de Salubridad, para ordenar ytemporalizar la incorporación de las EC a la cobertura efectiva del Fondo...
The goal of this paper is to determine the profile of total demand and potential supply in health services, available for high cost illness or catastrophic illness in the Fund for Protection againstCatastrophic Expenses (FPCGC by its Spanish initials) of the System of Social Protection in Health (SPSS). In the Funds financial designs basis, health reality was considered static bydeducting the effects of epidemic changes and not précising peoples health needs, or hidden demand. Thus, when this demand is revealed it becomes an effective demand for health institution and the plans used in the Funds financial calculations change. All in all, a methodological definition from the General Health Council is needed in order to organize and make CIs temporalfor the Funds coverage...
Este artigo tem como objetivo determinar o perfil da demanda total e oferta potencial de serviços de saúde, e disponibilizá-lo para doenças de custo alto ou doenças catastróficas no Fundo para a Proteção contra Despesas Catastróficas (FPCGC) do Sistema de Proteção Social em saúde (SPSS). Nos fundamentos financeiros do fundo foi considerada como estática a realidade sanitária, mas descontando os efeitos das mudanças epidemiológicas e não definindo as necessidades de saúde da população, a demanda oculta. Assim, quando essa demanda se desvendar, vai se tornar demanda efetiva para as instituições de saúde e as hipóteses de planeamento utilizados no cálculo finandeiro do Fundo vao se frustrar. Conclue-se, portanto, que uma definição metodológica do Conselho Geral de Saúde visando ordenar e temporalizar a incorporação das EC na cobertura efetiva do Fundo é essencial...